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【染色质免疫共沉淀】ChIP 抗体如何选择?

作者:admin信息来源:达科为日期:2019年12月23日打印字体:  
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随着时间的推移,表观遗传学的研究工具已经从PCR到qPCR,并演变出在全基因组范围内进行研究和分析的染色质免疫沉淀技术,也就是目前火热的ChIP技术。

染色质免疫共沉淀技术(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP也称结合位点分析法,是研究体内蛋白质与DNA相互作用的有力工具,通常用于转录因子结合位点或组蛋白特异性修饰位点的研究。

将CHIP与第二代测序技术相结合的ChIP-Seq技术,能够高效地在全基因组范围内检测与组蛋白、转录因子等互作的DNA区段。首先通过染色质免疫共沉淀技术(ChIP)特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段,并对其进行纯化与文库构建;然后对富集得到的DNA片段进行高通量测序。研究人员通过将获得的数百万条序列标签精确定位到基因组上,从而获得全基因组范围内与组蛋白、转录因子等互作的DNA区段信息。

由于ChIP实验的准确性和覆盖范围优于PCR、qPCR,ChIP-seq现已成为染色质研究的金标准但是,成功ChIP-seq,在ChIP实验的所有步骤中都需要较高水平的实验准确性和一致性。

ChIP抗体的选择在实验中是最重要的一个环节,它影响着ChIP实验的成败与否。那么ChIP-seq抗体需要如何选择呢?


单克隆抗体和多克隆抗体都可以用于ChIP实验吗?


无论是单克隆还是多克隆抗体都可用于ChIP实验。单克隆抗体识别靶蛋白上的单一表位,它们具有很高的特异性结合,低非特异性结合和低背景信号等特点。其次,由于克隆性质的低变异性,单克隆抗体具有更高的批次间稳定性。

但是,如果存在其它与染色质结合的蛋白,可能导致单克隆识别的表位不可接近;或由于需要识别的表位在交联过程中被掩蔽,单克隆抗体不能有效地与蛋白结合。幸运的是掩蔽的情况并不常见,因此,单克隆抗体不仅适用于ChIP实验,而且通常具有较好的实验结果。

与单克隆抗体相比,多克隆抗体能识别靶蛋白上的多个表位,即使存在少数表位掩蔽的情况,也不会影响抗体有效地检测到靶标,实验成功率更高。也正是由于多克隆抗体可以识别多个表位,从而会增加抗体发生非特异性结合的概率。

ChIP级别的抗体对抗体纯度、特异性结合的要求都比较高,是完成ChIP实验的首选抗体。如果没有找到目的基因的ChIP-seq级别的抗体,通过ChIP和IP验证的抗体也可以使用,但是尽量不要使用没有标注ChIP应用的抗体,或者标注未检测的抗体,否则通常是浪费时间。


如何快速确定抗体是否适合用于ChIP实验?


为了节省筛选候选抗体的时间,我们可以考虑抗体来自其他免疫实验检测的数据,它们作为抗体在ChIP中工作良好的可能性的指标。蛋白印迹和免疫沉淀测定可以验证抗体是否能识别正确的靶标;免疫荧光分析可以确定抗体是否识别其天然状态的靶标,这些数据对于检测抗体是否适合ChIP实验非常重要。

经过免疫沉淀、免疫荧光或免疫组织化学中验证的抗体,比仅通过Western blot验证的抗体更有可能产生阳性的ChIP实验结果。当然,这些应用中的性能并不能保证ChIP的成功,因为成功的ChIP抗体必须识别可接近的抗原表位,这些表位不应该ChIP交联方法的影响。

因此,想知道一支抗体的ChIP数据是否可用,可考虑如下相关问题:

  • 得到该数据使用的抗体是否与你购买的产品相同?
  • 有没有人使用这种抗体进行ChIP实验?
  • 有没有已知的用于验证阴性IgG对照和阳性对照引物组?


如何选择高特异性的ChIP抗体呢?


选择ChIP抗体和进行ChIP实验之前,对抗体的特异性评估很重要。尤其是组蛋白相关抗体的选择更是如此。

同时,很多期刊杂志也逐渐将组蛋白抗体特异性表现作为文章发表的条件,因此,进行抗体筛选测定以检测抗体质量和结合能力是非常重要的。

ChIP抗体选择的关键是:

  • 单克隆抗体和多克隆抗体都可以应用于ChIP实验;
  • 理想的ChIP抗体是经过ChIP验证;
  • 通过免疫实验(IP/IHC)验证的抗体比Western Blot验证的抗体更适合用于ChIP实验;
  • 进行独立的特异性筛选。


还在为选择ChIP抗体发愁吗?


Premium抗体通过了最严格的QC测试 (包括生物信息学,并与Broad Institute的Encode参考数据集进行了比较)。Diagenode的合作伙伴认为,这些抗体可能是最好的,具有最高性能的抗体,它们很可能会成为下一个国际标准。

Diagenode的研发工作符合国际人类表观基因组协会(IHEC)的总体目标。IHEC联合会给出的建议指南在任何表观基因组项目中绘制以下6个组蛋白修饰图:H3K4me3,H3K9me3,H3K27me3,H3K27ac,H3K4me1和H3K36me3。H3K4me3和H3K9Ac这两种组蛋白修饰通常富集在激活的启动子区域上;H3K4me1和H3K27Ac这两种组蛋白修饰通常富集在基因的增强子区域;H3K36me3和 H3K79me2这两种组蛋白修饰通常富集在RNA聚合酶延伸区域 ;H3K27me3和H3K9me3这两种组蛋白修饰用于抑制基因表达。



鉴于对高品质抗体的要求,ChIP-seq级抗体需要建立最严格的QC程序。Diagenode的Premium抗体已通过众多合作和IHEC表观遗传学专家社区开展的广泛工作达到了最高验证水平。现有抗体均经过ChIP-seq验证,对于几乎所有表观遗传应用均显示出卓越的性能。


Diagenode厂家对ChIP-seq级别抗体进行严格验证,并遵循IHEC给出的建议指南对ChIP抗体进行检测,为您提供可以信任的抗体,如图。




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澳客彩票网 Diagenode,将生产最高质量标准的CHIP抗体作为公司经营理念的一部分,并努力不断改进抗体的质控流程,使用高度标准化的ChIP-seq抗体检测流程,对Diagenode Premium抗体进行全面的验证。

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